Маркёры апоптоза и методы изучения апоптотической гибели клеток. Современные проблемы науки и образования Что будем делать с полученным материалом

Кардинальное влияние на течение ряда патологических процессов в организме может оказывать как ускорение, так и замедление апоптоза . Вещества, участвующие в регуляции апоптоза, как правило, являются белками, а их синтез контролируется соответствующими генами . Одинаковые гены, регулирующие уровень апоптоза, можно обнаружить у живых существ, стоящих на самых различных ступенях эволюционной лестницы. К числу генов, стимулирующих апоптоз относятся гены p53, Bax, bcl-xS. С другой стороны, были описаны гены, синтезирующие белки, ингибирующие апоптоз (Bcl-2, Ced-9, BHRF1, MCL-1). Про- и антиапоптозные белки способны объединяться друг с другом, формируя гомо- и гетеродимеры. Например, при объединении ингибитора апоптоза белка Bcl-2 c белком активатором апоптоза Bax итог (торможение или активация апоптоза) будет определяться тем, какой белок будет преобладать в этом объединении .

Наиболее яркими и информативными белками, отражающими протекающие синтетические процессы в клетках и тканях, являются белки семейства Bcl-2, которые занимают центральное место в изучении регуляции процесса апоптоза. Механизм регуляции этого процесса целесообразно рассматривать с позиции структурно – функциональных взаимоотношений между белками этого семейства, которые позволяют объединить их в одно семейство – белков Bcl-2 . Белки этого семейства Bcl-2 находятся в постоянном динамическом равновесии, образуя гомо- и гетеродимеры, что в конечном счёте влияет на развитие апоптоза клеток . Поэтому считается, что соотношение активных форм этих белков определяет равновесие между жизнью и смертью клетки.

К настоящему времени известно, что белки семейства Bcl-2 относятся либо к индукторам апоптоза (Bad, Bax, J3ik, Bid, Bak), либо к ингибиторам (Bcl-2, Bcl-X). Белок семейства Bcl-2 относится к классу G – белков . Белок с молекулярной массой 26 кДж, кодируемый геном Bcl-2, содержит трансмембранный домен и локализуется в митохондриальной мембране, перинуклеарном эндоплазматическом ретикулуме, ядерной мембране и в митотических хромосомах .

Bcl-2 является фактором выживания клетки, защищая её от программированной гибели, и проявляет онкогенное свойство, так как препятствует апоптозу . Ген Bcl-2 выполняет функцию негативного регулятора апоптоза. Установлено, что уменьшение концентрации Bcl-2 приводит к апоптотической гибели клеток, тогда как сверхэкспрессия его защищает клетки от смерти .

Наиболее хорошо изучена последовательность событий, приводящих клетку к апоптозу в результате взаимодействия белков из семейства TNF со специфическими рецепторами. Ярким представителем этой группы белков является система Apo-1/Fas/FasL. Следует отметить, что для этой системы не известны другие функции, кроме как индукции апоптоза клетки.

Apo-1/Fas/CD-95 – рецептор, по структуре, относящийся к рецепторам семейства TNF . Взаимодействие Apo-1/Fas (рецептор) с FasL (лиганд) или с моноклональными антителами приводит к апоптозу клетки. Apo-1/Fas конститутивно экспрессируется на поверхности клеток многих типов: на тимоцитах, лимфобластоидных клеточных линиях, активированных Т- и В-лимфоцитах, а также на фибробластах, гепатоцитах, кератиноцитах, миелоидных клетках. Человеческий Apo-1/Fas состоит из 325 аминокислотных остатков и относится к мембранным белкам I типа. Т.е. в его структуре можно выделить внеклеточный, трансмембранный и цитоплазматический домены. Гомология аминокислотной последовательности среди рецепторов семейства TNF высока. Примерно 80 аминокислотных остатков образуют домен смерти (DD), который вовлекается в белок-белковое взаимодействие с цитоплазматическими белками, генерируя сигнал смерти. Ген Apo-1/Fas у человека локализован в длинном плече хромосомы 10 и состоит из 9 экзонов .

FasL является цитокином и относится к семейству цитокинов TNF. FasL экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и натуральных киллерах, а также на клетках Сертоли и паренхимных клетках передней камеры глаза, что позволяет этим клеткам убивать любую Fas-экспрссирующую клетку, в том числе и активированный Т-лимфоцит. Этот механизм определяет появление защищённых от иммунной системы мест. FasL существует в двух формах – нерастворимой или мембраносвязанной и растворимой, отщепляемой от клетки с помощью металлопротеиназы. Растворимая форма человеческого sFasL сохраняет свою активность. Подобно другим лигандам рецепторов семейства TNF, sFasL – гомотример связывается с 3 молекулами Apo-1/Fas.

При связывании лиганда с рецептором происходит олигомеризация цитоплазматических белков, таких как DD (домен смерти), относящего к рецептору, адапторного белка – FADD (Fas-ассоциированный домен смерти), содержащего DED – эффекторный домен смерти и прокаспазы-8. В результате этого процесса происходит активация апоптоз-специфической протеазы – каспазы-8 и развиваются характерные для апоптоза процессы. Мутации в гене fas или в гене FasL приводят к развитию аутоиммунных заболеваний.

Apo-1/Fas – это белок, который содержит 1 трансмембранную область, которая связываясь с FasL, индуцирует апоптоз в клетках-мишенях. Существует также не имеющая трансмембранного участка, растворимая, форма Apo-1 (sApo-1/Fas), которая присутствует в сыворотке крови и других биологических жидкостях. Согласно данным литературы, эта секреторная форма (sApo-1/Fas) может защищать клетки от Apo-1/лиганд индуцированного апоптоза и образуется путём отщепления аминокислотного остатка от трансмембранного домена .

В последние годы идентификацию апоптоза часто проводят, определяя активность каспаз, как инициаторных, так и эффекторных. В большинстве работ, проводимых с изучением активности каспаз, рассматривается каспаза-3, т.к. различные пути апоптотической гибели сходятся на ней, и её активация указывает на наличие апоптоза. Однако, если в исследование вводится определение активности каспазы-8, то помимо выявления программированной клеточной гибели как таковой, можно определить и путь её запуска, т.к. активация каспазы-8 указывает на рецепторный (внешний) механизм инициации процесса. Именно это является серьёзным преимуществом данного метода .

На сегодняшний день разработано более 60 различных методов выявления и изучения апоптотических клеток in vitro . В литературе описано несколько методических подходов к прижизненному выявлению апоптотических клеток in vivo. Эти методы базируются на качественной или количественной оценке событий, вызванных изменениями в наружной мембране клеток, избирательной фрагментацией ядерной ДНК, изменениями структуры внутриклеточных компонентов или их перераспределением, а также уменьшением pH цитоплазмы. Кроме того, встречаются атипичные формы апоптоза, при которых отсутствуют маркёрные апоптотические изменения .

По понятным причинам изучение механизмов апоптоза ГКС при ПОУГ у человека in vivo невозможно. В качестве косвенного показателя при изучении роли апоптоза в патогенезе ПОУГ проводилась оценка апоптотических маркёров в лимфоцитах периферической крови, характеризующих готовность последних к апоптозу . Для определения апоптотических клеток используются: лазерная сканирующая и проточная цитометрия, однофотонная эмиссионная компьютерная томография, магнитно – резонансная томография (МРТ), магнитно – резонансная спектроскопия, позитронно – эмиссионная томография . Также, для идентификации апоптотической гибели клеток применяются световая и флуоресцентная микроскопия с применением обычных методов фиксации и окрашивания, электронно – микроскопические методы, выявление олигонуклеосомной деградации ДНК in situ, иммуногистохимическое выявление белков – маркёров, участвующих в программированной гибели клеток, или фрагментированной ДНК, определение активности каспаз .

Изучение апоптоза на окрашенных стандартными способами препаратах применяется очень широко ввиду относительной простоты этих методов. Полученные при подсчёте апоптотически измененных клеток результаты выражают в виде так называемого апоптотического индекса. Критериями программированной гибели клеток могут выступать маргинация и пикноз хроматина, изменение контуров ядра, изменение контуров и фрагментация клеток, появление свободно лежащих ядер.

Для выявления программированной клеточной гибели в качестве субъективного метода часто используется флуоресцентная микроскопия. Исследуют как витально окрашенные клетки во взвеси, так и фиксированные препараты. При работе с живыми клетками широко применяется мечение аннексином V, позволяющим обнаружить на внешней стороне плазматической мембраны появляющийся в процессе апоптоза фосфатидилсерин.

При анализе клеток в условиях флуоресцентной микроскопии учитывают следующие признаки: размеры ядра (уменьшение), характер распределения хроматина (конденсация в глыбки неправильной формы, уплотнение), хроматиновые тела (сохранность мембранной изолированности), характер свечения ДНК. Апоптотическая ДНК выглядит конденсированной ярко-желто-зеленой. В жизнеспособных клетках акридин оранж вызывает диффузную зеленую флуоресценцию.

С помощью иммуногистохимических исследований определяют наличие белков, формирующих каскад биохимических процессов, приводящих к апоптозу. Часто к этой группе методов относят TUNEL и ИФА .

Многие исследователи отводят апоптозу ведущую роль в структурных изменениях диска зрительного нерва (ДЗН), обусловленных потерей ГКС . Роль апоптоза при развитии дегенеративных заболеваний, не вызывает сомнений. Имеется убедительный экспериментальный материал, свидетельствующий об участии апоптотического процесса в механизме ГОН при ПОУГ . Однако, в целом, клинические исследования факторов апоптоза у пациентов с разными стадиями глаукомы весьма ограничены, что затрудняет изучение их роли в патогенезе ГОН.

Страница источника: 265

Деление клеток в целом представляет собой достаточно однообразный процесс, называемый клеточным циклом. В нем существует большое число «контрольных точек», в которых осуществляется управление переходом клетки от одной фазы цикла к другой. Разрушение одной или нескольких «контрольных точек» может привести как к неуправляемой пролиферации, так и к гибели клеток, в частности к апоптозу. Морфологическая картина апоптоза со всеми характерными признаками (хроматолизом, отсутствием воспалительной реакции, клеточным каннибализмом и т. д.) была описана L. Graper и названа «физиологической элиминацией клеток». В 1971 г. J. Kerr предложил термин «апоптоз» (от лат. аро - с, ptosis - падать) по аналогии с опадающими с дерева то здесь, то там листьями. В течении апоптоза выделяют три фазы - раннюю (уменьшение размеров клетки, фрагментация DNA на большие фрагменты), промежуточную (дальнейшая фрагментация DNA) и позднюю (апоптозные тельца). Апоптоз играет важную роль в развитии плаценты человека. С течением беременности отмечается нарастание апоптозных изменений в нормально функционирующей плаценте.

Tertemiz et al.
в своей работе показали, что апоптоз вовлечен в механизмы физиологической регуляции васкулогенеза плаценты. Вас-кулогенез плаценты начинается с 21-го дня беременности и включает в себя появление гемангиобластов и ангиогенных клеточных островков. Был изучен васкулогенез плаценты с использованием гистологического (препараты, окрашенные гематоксилином и эозином), иммуногистохимического (выявление CD31), молекулярно-генетического (CD31-TUNEL - TdT-mediated X-dUTP nick end labeling) методов и трансмиссионной электронной микроскопии. В исследовании показано, что в ангиогенных клеточных островках отсутствуют CD31-положительные клетки. Однако, в клетках примитивных капилляров и в ряде стромальных клеток, расположенных между васкулогенными областями, была выявлена экспрессия CD31. При морфологическом исследовании препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, в этих клетках были выявлены признаки апоптоза - кариопикноз и апоптозные тельца. Степень выраженности апоптоза и васкулогенеза в плаценте была прямо пропорциональна.

Уровень апоптоза повышен при нарушениях беременности, таких как прерывание беременности на ранних сроках, эктопическая беременность, преэклампсия.
Пролиферация и дифференцировка цитотрофобласта и развитие сосудов в строме ворсин требуют адекватного обеспечения кислородом и питательными веществами, получаемыми из межворсинчатого пространства. Среди осложнений беременности задержка внутриутробного развития является одной из ведущих причин перинатальной смертности. Нарушение регуляции апоптоза приводит к снижению числа клеток синцитиотрофобласта, что влечет за собой уменьшение поступления питательных веществ к плоду и к задержке внутриутробного развития плода. Levy et al. связывают задержку внутриутробного развития с преэклампсией и табакокурением - состояниями, приводящими к кислородному голоданию ткани плаценты. В работе S. Y. Dai et al. были исследованы плаценты женщин без вредных привычек и гестоза, но у которых отмечалась задержка внутриутробного развития плодов. Авторы предположили, что апоптозные изменения клеток плаценты, находящихся в условиях кислородного голодания, могут регулироваться факторами, активирующимися в условиях гипоксии (hypoxia-inducible factor), - HIF-la, HIF-2a, HIF-1 p.

HIF-1 является основным фактором, обеспечивающим адаптацию клеток к гипоксии.
Он может изменять экспрессию ряда генов, ответственных за эритропоэз, гликолиз и ангиогенез. В то время как гетеродимер HIF-lp выявляется во всех клетках плаценты при любых условиях, HIF-la выявляется только при гипоксии. Реже в условиях кислородного голодания в клетках выявляется HIF-2a, также известный как EPAS-1. HIF-la и -2a mRNA выявляются в плаценте в течение всей беременности, но уровень их значительно варьирует в зависимости от срока беременности. Если уровень HIF-la mRNA остается постоянным, то уровень HIF-2a mRNA нарастает с течением беременности. В противоположность HIF-la HIF-2a в основном экспрессируется в клетках эндотелия, играя важную роль в ангиогенезе и гемопоэзе. В плаценте человека экспрессия HIF-la и HIF-2a максимально выражена на ранних сроках, что обеспечивает устойчивость клеток к физиологической гипоксии, имеющей место в этом периоде беременности. Кроме того, повышенная экспрессия этих факторов отмечена при преэклампсии.

Следствием стимулирующего влияния этих факторов на апоптоз является задержка внутриутробного развития плода.
Так, в исследовании S. Y. Dai et al. апоптозный индекс в синцитиотрофобласте ворсин составил 1,45+1,26% в группе с задержкой внутриутробного развития и 0,18±0,16 - в контрольной группе, где задержки внутриутробного развития плодов не отмечалось (р
В то же время макроскопически выявляемые инфаркты достоверно чаще отмечались в плацентах группы с задержкой внутриутробного развития (50%), чем в контрольной группе (22%). Степень отложения фибриноида в межворсинчатом пространстве также была незначительно выше в группе с задержкой внутриутробного развития. Митотическая активность элементов трофобласта и клеток крови и сосудов на сроках беременности 6 и 12-14 недель были изучены Challier et al. Авторы отметили при сроке беременности 6 недель наличие фигур митоза и присутствие Кд67-позитивных ядер в клетках цитотрофобласта и эритробластах. В цитотрофобласте ворсин число Ki67-позитивных ядер уменьшалось к 12-14 неделям беременности, сохраняясь лишь в клеточных островках экстравиллезного цитотрофобласта. В эритробластах к этому периоду Ki67 уже не выявляется. В эндотелиальных клетках в 6 недель беременности митотические фигуры и экспрессия Ki67 отсутствовали, в 12-14 недель беременности выявлялся лектин UEA1. Отсутствие на сроке беременности 6 недель митотических фигур и экспрессии Ki67 в клетках эндотелия и периваскулярных клетках указывает на прямую зависимость васкулогенеза от стромальных клеток, причем в большей степени, чем от трофобласта.

Контроль за клеточным циклом эукариотических клеток осуществляется семейством киназ, в частности циклин-зависимыми киназами. С первого триместра беременности в ядрах цитотрофобласта и эндотелии прилегающих к нему сосудов выявляется циклин D1, экспрессия которого прогрессивно нарастает к третьему триместру беременности. CDK4 выявляется в ядрах цитотрофобласта как в первом, так и в третьем триместре беременности, в то время как СОК4-позитивные клетки эндотелия отмечаются только в конце третьего триместра. Это позволяет предположить, что D1/CDK4 комплекс участвует в регуляции пролиферации клеток цитотрофобласта в течение всей беременности, а в контроле над ангиогенезом - в третьем триместре беременности. Нарушения эндокринного, иммунологического баланса, накопление свободных радикалов приводят к усилению апоптоза в тканях плаценты. Так, при преэклампсии нарушается дифференцировка цитотрофобласта и процесс его инвазии в матку, что во многом обусловлено апоптозом. Известно, что апоптоз значительно чаще встречается в зрелой плаценте при беременности, осложненной задержкой роста плода, причем в регуляции этого процесса главную роль играет белок р53, а протеин Вс1-2 в нем не участвует. Многочисленные исследования указывают на гиперэкспрессию р53, а следовательно, и на увеличение апоптозных клеток в цитотрофобласте при хорионкарциноме и пузырном заносе.

1

Маркова А.А. 1 Кашкина Е.И. 1 Рубцов В.С. 1 Лякишева Р.В. 1

1 Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского, Саратов

Проведен анализ экспрессии маркеров апоптоза и пролиферации у 61 больного неспецифическим язвенным колитом в зависимости от длительности, степени тяжести заболевания, локализации воспалительного процесса в толстой кишке. Группу сравнения составили 15 практически здоровых человек. Обследование пациентов проводилось с использованием клинических, лабораторных, эндоскопических, морфологических методов. В биоптатах слизистой оболочки толстой кишки определяли экспрессию иммуногистохимических маркеров Ki-67, P53, BAX и РЭА. В процессе исследования выявлено статистически значимое снижение показателей пролиферативной активности слизистой оболочки толстой кишки у больных неспецифическим язвенным колитом по сравнению с группой здоровых лиц, а также снижение процессов пролиферации и повышение экспрессии маркеров апоптоза по мере увеличения длительности и усугубления тяжести клинических проявлений заболевания.

неспецифический язвенный колит

маркеры апоптоза и пролиферации

1. Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. – М.: Триада-Х, 1998. – 496 с.

2. Гастроэнтерология и гепатология: диагностика и лечение: руководство для врачей / под ред. А.В. Калинина, А.Ф. Логинова, А.И. Хазанова. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: МЕДпресс-информ, 2011. – 864 с.: ил.

3. Brown D. Gatter K. Monoclonal antibody Ki-67: its use in histopathology // Histopathology. – 1990. – № 17. –

4. Bruno S., Darynkiewich Z. Cell cycle dependent expression and stability of the nuclear protein detected by Ki-67 antibody in HL-60 cells // Cell. Prolif. – 1992. – № 25. –

5. A comparison of proliferation markers (BrdUrd, Ki-67, PCNA) determined at each cell position in the crypts of normal human colonic mucosa / M. Bromley, D. Rew, A. Becciolini

et al. // Eur. J. Histochem. – 1996. – Vol. 40. – P. 89–100.

6. Holt P.R., Moss S.F., Kapetanakis A.M. Is Ki-67 a better proliferative marker in the colon then proliferating cell nuclear antigen? Cancer. Epidimiol // Biomarkers. Prev. – 1997. –

№ 6. – P. 131–135.

7. McCormick D., Chong C., Hobbs C. et al. Detection of the Ki-67 antigen in fixed and wax- embedded section with the monoclonal antibody MIB-1 // Histopathology. – 1993. –

№ 22. – P. 355–360.

8. Reed J. C. Bcl-2 and regulation of programmed cell death // J. Cell. Biol. – 1994. – Vol. 124. – P. 1–6.

Неспецифический язвенный колит (НЯК) является одним из наиболее тяжелых заболеваний желудочно-кишечного тракта, приводящим к инвалидности и смерти пациентов .

В последние десятилетия в различных странах мира отмечается рост заболеваемости НЯК, что, в значительной мере, связано с улучшением диагностики этого патологического процесса.

В настоящее время в диагностике НЯК используется комплексный подход с применением рентгенологического, эндоскопического, гистологического методов исследования. Одним из перспективных способов оценки состояния слизистой оболочки толстой кишки является иммуногистохимия с определением маркеров пролиферации и апоптоза .

Среди методов иммуногистохимического исследования наиболее широкое применение нашли маркеры апоптоза bcl и p53 . Известно, что белки семейства bcl относятся или к индукторам апоптоза (Bad, Bax, Bak и др.) или к ингибиторам апоптоза (Bcl-2, Bcl-XL, BOO и др.) . Следует отметить, что белок p53 выявляется во многих трансформированных клетках. Его функции направлены на предупреждение переноса поврежденной генетической информации от одного поколения клеток другому, в том числе за счет инициации апоптоза. Высокое содержание p53 приводит к повышению концентрации в клетке Вах и уменьшению концентрации bcl-2, что способствует гибели клетки путем апоптоза .

В качестве маркеров пролиферации используются несколько антигенов. Ядерный антиген пролиферирующих клеток (Proliferating Cell Nuclear Antigen) (PCNA) участвует не только в пролиферации клеток, но и в репарации ДНК после ее повреждения , что делает данный антиген условно специфичным к клеточному циклу, так как восстановление ДНК может осуществляться в фазе покоя . Другим антигеном, достоверно ассоциированным с фазами клеточного цикла, является Ki-67. Экспрессия этого белка наступает во время пресинтетической фазы, нарастает в течение клеточного цикла и резко уменьшается в фазе митоза . Этот белок, в отличие от PCNA, не участвует в репарации ДНК . Экспрессия Ki-67 дает возможность идентифицировать клетки, находящиеся во всех фазах клеточного цикла, кроме фазы покоя .

Цель исследования - провести анализ экспрессии маркеров апоптоза и пролиферации у больных неспецифическим язвенным колитом в зависимости от длительности, степени тяжести заболевания, локализации воспалительного процесса.

Материалы и методы исследования

Основную группу составил 61 пациент с НЯК в возрасте от 19 до 66 лет (27 женщин и 34 мужчины), группу сравнения - 15 практически здоровых людей. Обследование пациентов проводилось с использованием клинических, лабораторных, эндоскопических, морфологических методов, а также с помощью иммуногистохимического исследования биоптатов слизистой оболочки толстой кишки.

Пациенты с НЯК были разделены на группы в зависимости от степени тяжести клинических проявлений, длительности заболевания, локализации воспалительного процесса.

Пролиферативную активность клеток определяли по пролиферативному показателю Ki-67 по формуле:

где X - количество ядер в поле зрения микроскопа. Подсчет производился не менее чем в 10 полях зрения.

Об апоптозе судили по экспрессии белков p53 и BAX в поверхностном и железистом эпителии толстой кишки. Для оценки регенеративных процессов в слизистой оболочке толстой кишки при НЯК определялась экспрессия ракового эмбрионального антигена (РЭА).

Результаты исследования и их обсуждение

При иммуногистохимическом исследовании определялась зависимость экспрессии указанных маркеров от длительности НЯК, тяжести его клинических проявлений и распространенности воспалительного процесса в толстой кишке.

При статистической обработке полученных данных после проведения тестов на равенство дисперсий и нормальность распределения было доказано, что выборка не соответствует закону нормального распределения, поэтому для сравнения групп применялись непараметрические критерии. Для описания количественных признаков использовались медиана, верхний и нижний квартили.

Так, у здоровых лиц ИП Ki-67 составил 54 (46;67), что говорит о высокой пролиферативной активности клеток толстой кишки (таблица).

Индекс пролиферации Ki-67 клеток эпителия слизистой оболочки толстой кишки (%) у здоровых людей и больных неспецифическим язвенным колитом в зависимости от его длительности, тяжести течения и локализации

Анализируемые группы		Значения Ki-67	Достоверность различий
Группа сравнения
Длительность заболевания			р 0 ≤ 0,001 р 1 ≤ 0,02 р 0 ≤ 0,001 р 1 ≥ 0,05
Тяжесть течения средне-тяжелое			р 0 ≤ 0,004 р 2 ≤ 0,05 р 0 ≤ 0,004 р 2 ≤ 0,02
Локализация поражения дистальный левосторонний тотальный			р 0 ≤ 0,002 р 3 ≥ 0,05 р 0 ≤ 0,002 р 3 ≥ 0,05

Примечания:

• р 0 - достоверность различий с группой контроля;
• р 1 - достоверность различий с длительностью заболевания менее 1 года;
• р 2 - достоверность различий с легким течением заболевания;
• р 3 - достоверность различий с дистальной локализацией заболевания.

Экспрессия BAX у здоровых лиц отсутствовала в 80 % случаев, а в 20 % отмечалась низкая экспрессия маркера. Экспрессия РЭА отмечалась в 50 % случаев и также была низкой.

Все пациенты в зависимости от длительности заболевания были разделены на 3 группы: 1-я с НЯК длительностью до 1 года, 2-я с продолжительностью от 1 до 5 лет и 3-я - более 5 лет.

Как следует из таблицы, повышение ИП Ki-67 в группе больных с длительностью заболевания от 1 года до 5 лет по сравнению с 1 группой (р ≤ 0,02), можно объяснить повышенной пролиферативной активностью клеток, отражающей репаративные процессы в слизистой оболочке толстой кишки. Низкий ИП Ki-67 в группе пациентов с язвенным колитом длительностью до 1 года, составляющий 31(25;36), может свидетельствовать о выраженном снижении пролиферативных процессов в слизистой оболочке кишки в дебюте заболевания.

При исследовании показателя p53 в зависимости от длительности заболевания, закономерности экспрессии этого белка не выявлено, однако имеется различие в экспрессии этого маркера между группой здоровых лиц и группой больных с длительностью заболевания от 1 года до 5 лет (р ≤ 0,05) и более 5 лет (р ≤ 0,03).

Экспрессия BAX определялась как в поверхностном, так и железистом эпителии толстой кишки. Было установлено, что экспрессия данного маркера в поверхностном эпителии и в эпителии желез практически одинакова в каждом отдельном случае. Экспрессию BAX у больных НЯК выявляли в 100 % случаев, статистически значимые различия в экспрессии маркера были выявлены между группой сравнения и больными НЯК (р ≤ 0,01).

При сравнении интенсивности экспрессии РЭА отмечалось значительное ее повышение при увеличении длительности заболевания. В группе сравнения экспрессия РЭА проявлялась лишь в единичных случаях (р ≤ 0,003).

В зависимости от тяжести клинических проявлений НЯК также было выявлено изменение ИП Ki-67 (см. таблицу). ИП Ki-67 уменьшался у больных со среднетяжелой формой заболевания (р ≤ 0,05) и тяжелой формой (р ≤ 0,02) по сравнению с пациентами с легким течением, также имелось различие между группой здоровых лиц и пациентами с НЯК любой степени тяжести (р ≤ 0,004).

Изменение экспрессии маркера p53 зависело от тяжести течения обострения (12,5 % при легком течении; 35,7 % при средней степени тяжести и 50 % при тяжелом). Статистически значимые различия получены между группами здоровых лиц и пациентов с НЯК средней и тяжелой формами заболевания (р ≤ 0,03).

BAX и РЭА экспрессировали в 100 % случаев, однако, зависимости интенсивности экспрессии данных маркеров от степени тяжести клинических проявлений НЯК не выявлено. Установлены различия в экспрессии маркеров между группой сравнения и пациентами с НЯК независимо от тяжести клинических проявлений (р≤0,01).

При анализе зависимости ИП Ki-67 от локализации воспалительного процесса было выявлено значительное повышение экспрессии маркера в группе больных НЯК по сравнению со здоровыми людьми (р ≤ 0,002), однако при сравнительном анализе внутри основной группы статистически значимых различий между экспрессией маркера и различной локализацией процесса не получено (р ≥ 0,05).

Экспрессия р53 выявлялась не у всех пациентов. У больных с дистальным колитом положительный результат был получен только в 20 % случаев, с левосторонним у 18 % больных. При тотальном поражении кишечника экспрессия р53 обнаруживалась в 100 % случаев (р ≤ 0,03 по сравнению с дистальным колитом). Следует отметить, что экспрессия была наиболее интенсивна в участках с признаками метаплазии эпителия.

Интенсивность экспрессии BAX в группе с тотальным колитом была значительно выше, чем при дистальном колите (р ≤ 0,03).

Экспрессия РЭА не зависела от локализации воспалительного процесса, однако она была достоверно выше у больных НЯК по сравнению с группой сравнения (р ≤ 0,03).

При неспецифическом язвенном колите пролиферативная активность клеток эпителия слизистой оболочки толстой кишки значительно ниже, а показатели апоптоза выше, чем при отсутствии ее воспалительных изменений.

Увеличение длительности неспеци-фического язвенного колита сопровождается низкой пролиферативной активностью эпителия слизистой оболочки толстой кишки, что может ухудшать ее репарацию.

С нарастанием тяжести клинических проявлений неспецифического язвенного колита отмечается не только уменьшение степени пролиферативной активности клеток эпителия толстой кишки, но и увеличение показателей активации апоптоза.

При распространении воспалительного процесса на проксимальные отделы толстой кишки выявлено увеличение показателей апоптоза.

Рецензенты:

Шварц Ю.Г., д.м.н., профессор, зав. кафедрой факультетской терапии ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ имени В.И. Разу-мовского» Минздравсоцразвития России, г. Саратов;

Федорина Т.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой общей и клинической патологии: патологическая анатомия, патологическая физиология ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Самара.

Работа поступила в редакцию 09.12.2011.

Библиографическая ссылка

Маркова А.А., Кашкина Е.И., Рубцов В.С., Лякишева Р.В. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ МАРКЕРОВ АПОПТОЗА И ПРОЛИФЕРАЦИИ У БОЛЬНЫХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ ЯЗВЕННЫМ КОЛИТОМ // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 2. – С. 79-82;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29400 (дата обращения: 18.07.2019). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»

CAD (caspase activated DNase) на фрагменты размером, кратным 180-200 нуклеотидам . В результате апоптоза происходит образование апоптичних телец - мембранных везикул , содержащих целостные органеллы и фрагменты ядерного хроматина . Эти тельца поглощаются соседними клетками или макрофагами в результате фагоцитоза . Так как внеклеточный матрикс не поражается клеточными ферментами , даже при большом количестве апоптозных клеток, воспаление не наблюдается.

Процесс апоптоза является необходимым для физиологического регулирования количества клеток организма, для уничтожения старых клеток, для формирования лимфоцитов , которые не являются реактивными к своим антигенов (аутоантигенов), для осеннего опадения листьев растений , для цитотоксического действия Т-лимфоцитов киллеров, для эмбрионального развития организма (исчезновение кожных перепонок между пальцами у эмбрионов птиц) и других.

Нарушение нормального апоптоза клеток приводит к неконтролируемому размножению клетки и появления опухоли.

1. Значение апоптоза

Апоптоз - неотъемлемая часть жизнедеятельности большинства многоклеточных организмов. Особенно важную роль он играет в процессах развития. Например конечности четвероногих закладываются как лопатообразные вырасти, а формирование пальцев происходит благодаря гибели клеток между ними. Также подлежат апоптоза больше не нужны клетки, таким образом частности разрушается хвост у головастиков при метаморфозу. В нервной ткани позвоночных во время эмбрионального развития более половины нейронов погибают путем апоптоза сразу же после образования .

Также апоптоз является частью системы контроля за "качеством" клеток, он позволяет разрушать те из них, которые неправильно расположены, поврежденные, нефункциональные или потенциально опасные для организма. Примером могут служить и B-лимфоциты , которые погибают, если не несут полезных антиген -специфических рецепторов или несут автореактивни. Путем апоптоза также умирает большинство лимфоцитов аткивованих при инфекции после его преодоления .

У взрослых организмов одновременная регуляция пролиферации клеток и апоптоза позволяет поддерживать стали размеры целой особи и ее отдельных органов. Например, после вживавання препарата фенобарбитал , что стимулирует пролиферацию гепатоцитов, у крыс увеличивается печень . Однако, сразу же после прекращения действия этого вещества все лишние клетки подлежат апоптоза, в результате чего размер печени возвращается к нормальному .

Также апоптоз происходит, когда клетка "чувствует" большое количество внутренних повреждений, которые она не может репаруваты. Например, в случае повреждения ДНК клетка может трансформироваться в раковую, чтобы этого не произошло она, при нормальных условиях, "кончает жизнь самоубийством". Также погибает путем апоптоза большое количество клеток инфицированных вирусами .

2. Маркеры апоптических клеток

Маркеры апоптоза

Выявление фрагментации ДНК в апоптичних клетках методом TUNEL Препарат ткани печени мыши, ядро апоптичнои клетки имеет коричневую окраску, оптическая микроскопия.

Выявление фрагментации ДНК в апоптичних клетках с помощью электрофореза в агарозном геле. Слева: ДНК выделенной из апоптических клеток - видно "лесенку ДНК"; посередине: маркеры; дело: контрольный образец ДНК из необработанных клеток. Клеточная линия H4IIE (гепатома крыс), индуктором апоптоза - паракват, визуализация с помощью етидий бромида.

Сверху: выявление конденсации и фрагментации хроматина путем закрашивания флуоресцентным красителем (Hoechst 34580). Посередине: выявление транслокации фосфадидилсерину в наружный листок плазмалемме путем закрашивания аннексином V. Снизу: Микрофотография апоптических клеток в светлом поле. Клеточная линия - Jurkat, индуктор апоптоза - TRAIL, конфокальной и свитлопильна оптическая микроскопия .

Клетки, погибают путем апоптоза, можно распознать по ряду морфологических признаков. Они становятся меньше и более плотными (пикноз), округляются и теряют псевдоподии , в них разрушается цитоскелет , распадается ядерная мембрана , хроматин конденсируется и фрагментируется. На поверхности клеток появляется большое количество пузырьков, если клетки достаточно велики, то они распадаются на окружены мембранами фрагменты - апоптические тельца .

В апоптичних клетках кроме морфологических происходит также большое количество биохимических изменений. Частности ДНК разрезается специальными нуклеазами в линкерних участках между нуклеосомы на фрагменты равной длины. Поэтому при разделении всей ДНК апоптичнои клетки с помощью электрофореза можно наблюдать характерную "лесенку". Другой метод выявления фрагментации ДНК - метки ее свободных концов с помощью метода TUNEL ( T erminal deoxynucleotidyl transferase d U TP n ick e nd l abeling ) .

Изменения претерпевает также и плазматическая мембрана апоптичних клеток. При нормальных условиях отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин содержится только в ее внутреннем (возвращенном к цитозоля) слое, однако во время апоптоза он "перескакивает" в наружный листок. Эта молекула служит сигналом "съешь меня" для ближних фагоцитов . Фосфатидилсерин-индуцированное поглощение апоптических клеток, в отличие от других типов фагоцитоза, не приводит к выделению медиаторов воспаление . Описанная изменение плазмалемме лежит в основе еще ​​одного метода выявления клеток, погибающих путем апоптоза - окрашивание анексином V, специфически связывается с фосфатидилсерина .

3. Каспаз - медиаторы апоптоза

Клеточные системы, которые обеспечивают прохождение апоптоза, аналогичные у всех животных, центральное место в них занимает семья белков каспаз. Каспаз - это протеазы , имеющие в активном центре остаток цистеина , и разрезают свои субстраты по специфическому остатка аспарагиновой кислоты (отсюда название: c от cysteine и asp от aspartic acid ). Каспазы синтезируются в клетке в виде неактивных прокаспаз, которые могут становиться субстратами для других, уже активированных каспаз, что режут их в одном или двух местах по остатку аспартата. Два образованы фрагменты - больший и меньший - соединяются между собой, формируя димер, что ассоциирует с таким же диммером. Сформированный таким образом тетрамер и является активной протеазой, что может разрезать белки-субстраты. Кроме участков, соответствующих большей и меньшей субъединиц, прокаспазы иногда также содержат ингибиторные продомены, которые деградируют после отщепления.

В результате расщепления и активации одних каспаз другими формируется протеалитичний каскад, который существенно усиливает сигнал и делает апоптоз с определенного момента необратимым процессом. Те прокаспазы, которые начинают этот каскад называются инициаторным, а их сусбтраты - эффекторными. После аткивации эффекторные каспазы могут расщеплять другие эффекторные прокаспазы или белки-мишени. До мишеней эффекторных каспаз, которые разрушаются во время апоптоза относятся в частности белки ядерной ламины, розщелення которых приводит к распаду этой структуры. Также деградирует белок, при нормальных условиях подавляет эндонуклеазы CAD, вследствие этого начинается фрагментация ДНК. Расщепляются каспаз и белки цитоскелета и межклеточной адгезии , вследствие чего апоптические клетки округляются и отсоединяются от соседних клеток, и таким образом становятся легче мишенью для фагоцитов .

Набор каспаз, необходимый для прохождения апоптоза зависит от типа ткани и пути, по которому активируется клеточная смерть. Например у мышей при "выключении" гена, кодирующие эффекторные каспазы-3, апоптоз не происходит в мозге, однако нормально протекающей в других тканях .

Гены прокаспаз активны в здоровых клетках, а следовательно белки необходимы для протекания апоптоза постоянно присутствующие, нужна лишь их активация для запуска клеточного суицида. В состав инициаторных прокаспаз входит длинный продомен, содержащий CARD ( caspase recruitment domain , Домен привлечения каспаз). CARD позволяет инициаторным прокаспазы присоединяться к адаптерных белков образуя активационные комплексы, когда клетка получает сигнал, что стимулирует апоптоз. В активационных комплексах несколько молекул прокаспаз оказываются непосредственно вблизи друг друга, чего достаточно для их перехода в активное состояние, после чего они разрезают друг друга .

Два лучше изучены сигнальные пути активации каскада каспаз в клетках млекопитающих называются внешний и внутренний (митохондриальный), каждый из них использует собственные инициаторным прокаспазы .

4. Пути активации апоптоза

4.1. Внешний путь

Клетка может получать сигнал, индуцирующего апоптоз, извне, например, от цитотоксических лимфоцитов. В таком случае активируется так называемый внешний путь ( extrinsic pathway ), Начинающийся с рецепторов смерти. Рецепторы смерти - это трансмембранные белки , принадлежащие к семейству рецепторов фактора некроза опухолей (ФНО), например сам рецептор ФНО и рецептор смерти Fas. Они формируют гомотримеры, в которых каждый мономер имеет внеклеточный лиганд-Связной домен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен смерти, через адаптерные белки привлекает и активирует прокаспазы .

Лиганды рецепторов смерти также гомотримерамы. Они родственны между собой и принадлежат к семейству сигнальных молекул фактора некроза опухолей. Например, цитотоксические лимфоциты несут на своей поверхности лиганды Fas, которые могут присоединяться к рецепторам смерти Fas на плазмалемме клеток-мишеней. В таком случае внутриклеточные домены этих рецепторов соединяются с адаптерного белка ( FADD, Fas-associated death domain ), А те в свою очередь привлекают инициаторным прокаспазы 8 и / или 10. Вследствие этой серии событий формируется сигнальный комплекс, индуцирующего смерть, - DISC ( death inducing signaling complex ). После активации в этом комплексе инициаторным каспазы разрезают эффекторные прокаспазы и запускают апоптичнои каскад .

Многие клетки синтезируют молекулы, в определенной степени защищают их от активации внешнего пути апоптоза. Примером такой защиты может быть экспрессия так называемых рецепторов-приманок ( decoy receptors ), Имеющих внеклеточные домены связывания лигандов, однако не цитоплазматических доменов сметри, а следовательно не могут запускать апоптоза и конкурируют с обычными рецепторами смерти за лиганды. Клетки также могут продуцировать белки, блокирующие внешний путь апоптоза, например FLIP, похожий по структуре прокаспаз 8 и 10, однако не протеалитичнои активности. Он подавляет связывание инициаторных прокаспаз с комплексом DISC .

4.2. Внутренний путь

Апоптосома

Апоптоз также может запускаться изнутри клетки, например в случае ее травмирования, повреждения ДНК, недостатка кислорода , питательных веществ или внеклеточных сигналов выживания. У позвоночных этот сигнальный путь называется внутренним ( intrinsic pathway ) Или митохондриальной, ключевым событием в нем является высвобождение определенных молекул с межмембранном пространстве митохондрий. До таких молекул зокрема належить цитхром c, що за звичайних умов входить до електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, проте у цитоплазмі виконує іншу функцію - приєднується до адаптерного білка Apaf ( apoptotic protease actiuating factor-l ), Вызывая его олигомеризации в колесоподибну семичленну структуру, которая называется апоптосома. Апоптосома привлекает и активирует инициаторным прокаспазу-9, которая затем может активировать инициаторным прокаспазы .

В некоторых клетках внешний путь апоптоза должен активировать внутренний для того чтобы эффективно уничтожить клетку. Внутренний путь строго регулируется белками семьи Bcl-2 .

4.2.1. Регуляция внутреннего пути белками семьи Bcl-2

К семейству Bcl-2 относятся эволюционно консервативны белки, главной функцией которых является регуляция высвобождения цитохрома c и других молекул с мижмебранного пространства митохондрий. Среди них есть про-апоптические и анти-апоптические молекулы, которые могут взаимодействовать между собой в различных комбинациях, подавляя друг друга, баланс между их активностью и определять судьбу клетки .

Сейчас известно около 20 белков из этой семьи, все они содержат хотя бы один из четырех альфа-спиральных доменов гомологии Bcl2, называемых BH1-4 ( bcl2 homology ). Антиапоптични белки семьи Bcl2 содержат все четыре домены, к ним относятся сам Bcl-2, а также Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 и A1. Проапоптични белки делятся на две группы, члены первой из которых содержат три BH-домены (BH1-3), это в частности Bak, Bax и Bok (последний экспрессируется только в тканях репродуктивных органов). Наиболее многочисленной среди семьи Bcl-2 является вторая группа проапоптичних белков, которые содержат только домен BH3 (BH3-only), к ней относятся Bim, Bid, Bad, Bik / Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma .

При нормальных условиях (т.е. когда клетка не проходит апоптоза) антиапоптични белки, такие как Bcl-2 и Bcl-X L, связываются с проапоптичнимы белками BH123 (Bax и Bak) и не позволяют им полимеризоваться во внешней мембране митохондрий образуя поры. В результате действия определенного апоптичнои стимула в клетке активируются или начинают синтезироваться проапоптични белки, содержащие только домен BH3. Они в свою очередь ингибируют антиапоптични белки, снимая угнетающее действие на Bak и Bax, либо напрямую взаимодействуют с последними и способствуют их олигомеризации и образованию пор. Вследствие пермеабилизации наружной мембраны в цитозоль попадает цитохром c , а также другие медиаторы апоптоза, такие как AIF (англ. apoptosis inducing factor ).

Например, при недостатке сигналов выживания в клетке при посредничестве MAP-киназы JNK активируется экспрессия BH3 белка Bim, запускающий внутренний путь апоптоза. В случае повреждения ДНК происходит накопление супрессора опухолей p53 , который стимулирует транскрипцию генов, кодирующих BH3 белки Puma и Noxa, которые также обеспечивают прохождение апоптоза. Еще один BH3 белок - Bid обеспечивает связь между внешним и внутренним путями апоптоза. После активации рецепторов смерти и, как следствие, каспазы-8, последняя разрезает Bid с образованием усеченной формы tBid (truncated Bid), которая перемещается в митохонрий, где подавляет Bcl-2 .